Anh có trận ra mắt cho Argentina vào ngày 16 tháng 11 năm 1994, đấu với Chile, dưới thời huấn luyện viên Daniel Passarella.

Ayala chơi cho Argentina tại Thế vận hội mùa hè năm 1996, giành huy chương bạc. Anh chơi cho Argentina ở World Cup 1998 và là thành viên đội tuyển không chơi trong năm 2002 do một chấn thương do va chạm vào phút cuối trước trận đấu đầu tiên của họ với Nigeria. Sau đó ông là một cầu thủ quá tuổi cùng Argentina giành huy chương vàng tại kì Thế vận hội mùa hè 2004. Ayala là một phần không thể thiếu trong đội hình Argentina cho World Cup 2006 tại Đức. Anh đã chơi xuất sắc trong suốt giải đấu, và được chọn là một thành viên của đội All Star. Trong tứ kết với Đức anh ghi một bàn thắng bằng đầu giúp Argentina dẫn trước 1-0. Nhưng Argentina đã thua trong loạt sút luân lưu sau khi hòa 1-1, với quả phạt đền của Ayala bị bắt bởi Jens Lehmann.

Ngày 30 tháng năm 2006, trong một trận đấu giao hữu với Angola, Ayala hoàn thành 100 lần khoác áo Argentina.[6]

Một trong những hậu vệ tốt nhất trong lịch sử của Argentina, vào ngày mồng 07 tháng 2 năm 2007, Ayala trở thành cầu thủ khoác áo đội tuyển nhiều nhất của đội tuyển quốc gia(phần lớn là làm đội trưởng), đánh bại người bạn của ông Diego Simeone, trong chiến thắng 1-0 trong trận giao hữu với Pháp tại Stade de France, Paris.

Vào ngày 5 tháng 6 năm 2007, trong một trận giao hữu với Algeria, Roberto Ayala đã lập kỉ lục đeo băng đội trưởng đội tuyển Argentina lần thứ 58, trước đó đã san bằng kỉ lục 57 trận với Diego Maradona trong trận hòa 1–1 trong trận hòa 1-1 với Thụy Sĩ ở Basel vào thứ bảy 02 tháng 6.[7]

Vào ngày 17 tháng 7 năm 2007, sau khi chơi trong trận chung kết Copa América 2007 với Brazil, trong đó ông đã có một bàn phản lưới nhà, Ayala công bố giã từ đội tuyển quốc gia.[8]